国产精品无码2021在线观看-国产精品污-国产精品网站在线进入-国产精品网站在线观看-四虎免费久久影院-四虎毛片

  1結果與分析

  1.1 SDS-PAGE電泳
  4種花穗型裘皮的8份樣品經蛋白質定量(BCA法,上樣量為20μg)后，用SDS-PAGE電泳進行分離，最終獲得的蛋白質條帶(圖1)，其平行度較好，條帶較均一。
  1.2蛋白鑒定及其整體分布
  4種花穗裘皮樣品經i TRAQ技術中的強陽離子交換柱分離，獲得8組肽，經MS儀器分析，結果經Mascot查庫，之后以Peptide FDR≤0.01為參照篩選過濾。結果有12 988個肽段(Peptide)被鑒定出，得到共計2 886個蛋白質組(Protein group)。以其相對分子質量、肽段數量及肽段序列覆蓋率為依據對鑒定出的所有蛋內質進行統計，結果顯示利用i TRAQ技術鑒定出的不同花穗裘皮樣品中的蛋白，其中分子量在20～80 k D(A)之間的蛋白質數量較多，包含5個以內(B)的肽段的蛋白數量居多，蛋白覆蓋率則大多集中于0%～20%之間(C)(圖2)。
  圖1 樣品SDS-PAGE電泳
  
  Figure 1 Sample SDS-PAGE electrophoresis
  注:A1,A2:串子花型;B1,B2:軟大花型;C1,C2:綠豆絲型;D1,D2:其它不規則型
  1.3各組顯著性差異蛋白定量分析
  分別統計軟大花型(B)與串子花型(A)、綠豆絲型(C)與串子花型(A)、其它不規則型(D)與串子花型(A)3個比對組得到的差異蛋白數量，對其進行分析，并定義其中ratio>1.3且p<0.05的蛋白為上調的蛋白，符合ratio<0.77且p<0.05的蛋白為下調的蛋白，分析各比較組的差異蛋白具體統計結果(表1)。
  依照各比較組篩選出的差異蛋白的數目，除未命名蛋白外，列出各比較組已鑒定出的存在顯著差異的蛋白，得到其統計結果(表2)。
  統計分析3組經對比得到的差異蛋白，發現共有56個差異蛋白共同存在于B VS A與C VS A組中，其中上調蛋白21個，下調蛋白35個；而有46個相同的差異蛋白同時存在于B VS A與D VS A兩組中，其中上調蛋白數19個，下調蛋白數27個；有59個相同的差異蛋白存在于C VS A與D VS A兩組中，屬于上調蛋白的22個，屬于下調蛋白的37個；并且有36個相同的差異蛋白同時存在于B VS A、C VS A、D VS A組中，其中上調蛋白數為13個，下調蛋白數為23個，得到統計結果(圖3)。所列出的差異蛋白主要是促甲狀腺激素釋放激素降解酶、細胞周期蛋白依賴性激酶5、非特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等蛋白酶類(表2)。
  1.4 GO分析
  3個比較組得到的差異蛋經過GO(Gene ontology)分析，結果在B VS A組的差異蛋白中發現其所涉及到的分子功能共有11種，生物學過程與細胞組成分別為22種和16種(圖4A)；在C VS A組中發現的差異蛋白共涉及到分子功能12種，生物學過程22種，細胞組成15種(圖4B);D VS A組中涉及到的分子功能共7種，生物學過程共22種，細胞組成共11種(圖4C)。本試驗檢測出的3個比較組的差異蛋白主要涉及到催化、轉運蛋白、抗氧化、分子功能調節劑等眾多重要分子功能；涉及到生物的生長、生殖、代謝及免疫系統等一系列重要生物學過程；涉及到大分子復合物、細胞連接、細胞器、細胞外基質等細胞組成。
  圖2 i TRAQ鑒定蛋白的總概況
  
  Figure 2 i TRAQ to identify the total protein profiles
  注:A:鑒定蛋白的質量分布;B:蛋白所含肽段的數量分布;C:肽段的序列覆蓋度
  圖3 各比對組差異蛋白分析
  
  Figure 3 Analysis of each match differentially expressed proteins
  1.5 KEGG分析
  對三比較組得到的差異蛋白進行KEGG生物通路富集分析，按p值分析各組的KEGG通路，由左至右p值增大，以p<0.05與p<0.01對其進行分類(圖5),B VS A組中的差異蛋白涉及碳代謝、VEGF(Vascular endothelial growth factor)信號通路、丙酮酸代謝、花生四烯酸代謝、NOD樣受體信號通路、FcεRI信號通路等共計14條通路(圖5A)。C VS A組中比對得到的差異蛋白涉及丁酸代謝、維生素B6代謝、各種氨基酸代謝與降解及脂肪酸的代謝與降解等共計13條具體代謝通路(圖5B)。在D VS A比對組中得到的差異蛋白涉及丙酸酯代謝、氨基酸代謝及降解、脂肪酸代謝及降解、芳香化合物的降解等共計21條代謝通路(圖5C)。
  表1 差異蛋白統計
  
  表2 各比對組差異表達蛋白
  
  
  

  2討論

  2.1 KAP3
  羊毛纖維幾乎全部由蛋白質組成，主要組成成分是角蛋白與角蛋白相關蛋白(keratin-associated proteins,KAPs)，而KAPs則通過與角蛋白的相互作用影響毛纖維的機械性能(Plowman et al.,2015)。以毛纖維中所含半胱氨酸或甘氨酸與酪氨酸殘基的比例為依據，人為地將KAPs又分為高硫蛋白(high-sulphur proteins,HSPs)、超高硫蛋白(ultrahigh-sulphur proteins,UHSPs)和高甘氨酸-酪氨酸(high-glycine-tyrosine proteins,HGTPs)蛋白(Rogers,2006)。有研究發現不同KAPs基因與羊毛絨品質具有一定的關聯性(高建軍等,2014)，這一觀點與之前研究發現的細毛羊毛纖維中KAPs中的HSPs基因與毛纖維細度有著極大的關聯(劉桂芬等,2007)相吻合。KAP3屬于HSPs關聯蛋白家族的一種，其中還包括KAP1和KAP2兩種蛋白(Plowman et al.,2009)。已有相關研究發現KAP3.2基因與藏系綿羊毛長和產毛量性狀存在相關性，并可作為這兩個性狀的分子標記(王志有等,2011)。有研究者利用RT-PCR技術研究藏綿羊KAP3.2基因的結構與功能，結果發現該基因在皮膚組織的表達存在特異性，對羊毛性狀具有重要影響(楊珂偉等,2014)，而且KAP3.2基因在新吉毛羊超細型中的表達量極顯著地高于其在新吉細型細毛羊中的表達量，可能影響毛纖維機制表達的代謝(劉春潔等,2015)。研究發現KAP3.3在羊毛纖維皮質層表達(Plowman et al.,2009)，進一步研究發現KAP3.3基因以組織特異性方式在羊皮膚毛囊中高度表達(Zhao et al.,2016)。本試驗中KAP3是在C VS A對比組中發現的差異蛋白，且為下調蛋白，較綠豆絲型裘皮而言，串子花型裘皮中的KAP3高度表達，故而KAP3可能在灘羊串子花型毛股結構的形成過程中起重要作用。
  2.2 KAP6
  H GTPs家族包括KAP6、KAP7和KAP8等蛋白，在毛纖維的主要結構及機械性能方面扮演著重要的角色(Liu et al.,2014)。KAP6在羊毛纖維中的表達量會對毛纖維直徑產生一定的影響(Cockett et al.,2001)。已有研究顯示綿羊羊毛纖維直徑的變化受到了KAP6.1基因變化的影響，并且在KAP6.1基因的57 bp片段缺失后，粗羊毛纖維直徑的相關特性會發生極大變化(Zhou et al.,2015)。有研究者用PCR-SSCP方法對絨山羊KAP6.3基因編碼區和3'-非翻譯區進行多態性掃描，并分析其變異與絨山羊絨毛性狀的關系，結果發現絨毛的長度、細度、產絨量均受KAP6.3不同SNPs位點的影響(劉海英,2007)。之后有人用同樣的方法研究了高原型藏山羊產絨性狀與KAP6.1和KAP6.2基因位點間的關系，結果顯示KAP6.1主要影響產絨量性狀，而KAP6.2基因與藏山羊的絨毛長度、細度等存在更大地相關性(王杰等,2010)，并于2016年，有研究者發現了羊KAP6.4和KAP6.5這兩個新的基因，進一步完善了KAP6基因家族(Zhou et al.,2016)。在本試驗中KAP6同樣是在C VS A對比組中發現的差異蛋白，其ratio<0.77，故較KAP6在綠豆絲型裘皮中的表達而言，KAP6在串子花型裘皮中屬于高度表達，從KAP6在灘羊不同花穗型裘皮的表達量可推測，KAP6在灘羊串子花型裘皮中高度表達與其串子花型毛股形成有著緊密的聯系。
  圖4 差異蛋白GO注釋
  
  Figure 4 Differential protein GO annotation
  注:A:軟大花型/串子花型;B:綠豆絲型/串子花型;C:其它不規則型/串子花型
  圖5 差異蛋白KEGG富集分析
  
  Figure 5 Differential protein KEGG enrichment analysis
  注:A:軟大花型/串子花型;B:綠豆絲型/串子花型;C:其它不規則型/串子花型
  2.3膜聯蛋白
  膜聯蛋白是一類磷脂結合蛋白，它的表達受到鈣離子的調控。作為膜聯蛋白多基因家族成員之一膜聯蛋白A2則廣泛表達于多細胞生物體內，并在多種類型的細胞中均有存在，起初發現于Rous肉瘤病毒轉化的雞胚胎成纖維細胞中(Hastie et al.,2008)。研究表明，膜聯蛋白A2與多種炎癥機制的反應有關，而且參與細胞粘附及胞吐等過程，并且在宮頸組織中的過度表達與宮頸癌的發生發展關系密切(趙麗萍和陸曉媛,2010)。有研究表明，膜聯蛋白A2與人類多種心血管、腫瘤及病毒感染疾病有關，當膜聯蛋白A2的表達量較高時，纖溶酶的表達量增多，加快細胞外基質的降解，對血管再生有一定的積極作用(聶紀芹等,2012;Yi et al.,2016)，而且李璟波等(2015)還發現膜聯蛋白A2在非小細胞肺癌的診斷中具有一定的意義。本試驗中，膜聯蛋白相對而言在軟大花型中的表達量較高，為上調蛋白，通過生物信息分析，發現其主要涉及到代謝過程的調節、營養水平反應的調節、對細胞外環境刺激的應答反應等生物學過程，并且與細胞的多種組成成分密不可分，涉及到陰陽離子結合、鈣依賴性磷脂結合等系列分子功能。因此可推測其與軟大花型毛股的形成具有一定的關聯。
  2.4 VEGF信號通路
  血管內皮生長因子(VEGF)是主要作用于血管內皮細胞的血管生成因子，與血管正常的生長、發育以及傷口愈合有著密切的關系，與血管腫瘤生長和轉移等過程有關，是一種促進血管生成活性的功能性蛋白，目前發現的VEGF主要有胎盤生長因子與VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D等5個成員(Nash et al.,2006;Saito et al.,2007)。VEGF信號通路具有啟動并調節胚胎血管的發育的作用(Aguago et al.,2002;姜懷志等,2010)。VEGF特異性作用于內皮細胞調控著血管新生，影響著血管的通透性，并與其它因子協同作用，促進血管內皮細胞增殖、遷移，誘導血管生長、形成及其相關蛋白酶的合成(Jalali et al.,2001;Wagatsuma,2007;姜懷志,2012)。VEGF對皮膚毛囊血管新生具有重要意義，調控著毛囊的周期性變化(姜懷志,2012)。已有研究發現VEGF可以促進毛囊發育,并影響毛囊直徑(Araújo et al.,2011)。無獨有偶，有研究者測定了遼寧絨山羊常年長絨和季節長絨兩個品系皮膚毛囊中VEGF的相對表達量，發現遼寧絨山羊常年長絨型品系常年長絨可能與VEGF基因m R-NA的相對表達量常年維持在一個較高的水平有關(姚紀元等,2010)。之后又有人發現在胎兒期，絨山羊體內的VEGF與皮膚上微血管密度呈顯著強的正相關(谷博等,2013)，這說明VEGF可增加毛囊的微血管密度，以利于毛囊發育。并且早期有研究已表明VEGF能維持毛囊超微結構的完整性，促進毛囊生長(Bruno et al.,2009)。本試驗中對B VS A組的差異蛋白進行KEGG通路分析發現其涉及VEGF信號通路，在軟大花型裘皮中涉及VEGF信號通路的差異蛋白有較高表達量，屬于上調蛋白，故而可推測VEGF信號通路所涉及的差異蛋白在灘羊二毛期花穗形成過程中的高表達有利于產生更多的絨毛，形成軟大花型毛股。

  3材料與方法

  3.1樣品采集
  4種灘羊二毛期的不同花穗型裘皮樣品均采集于寧夏鹽池的灘羊選育場(圖6)，取樣部位為羊體側肩胛骨后緣1 cm2處，每種花穗型裘皮的灘羊采2份樣品，共8份，采集的樣品經生理鹽水處理，立即置于裝有干冰的泡沫盒中，帶至實驗室，保存于超低溫冰箱(-80℃)備用，得到樣品信息(表3)。
  3.2實驗儀器與試劑
  E PS601 600V電泳儀、AKTA Purifier 100純化儀均由GE Healthcare提供；Q-Exactive質譜儀、納升級液相色譜儀(型號:Easy n LC1000)均購于Thermo Finnigan；低溫高速離心機，型號為Eppendorf 5430R;Eppendorf Concentrator plus真空離心濃縮儀；UV-2100型可見紫外分光光度計(尤尼柯WFZ)。
  圖6 灘羊二毛期不同毛股花穗型
  
  Figure 6 Tan sheep er-mao different hairs spike type
  注:A:串子花型;B:軟大花型;C:綠豆絲型;D:其它形態
  表3 樣品信息
  
  SDS(161-0302,Bio-Rad),Urea(161-0731,Bio-rad),Trisbase(161-0719,Bio-rad),DTT(161-0404,Bio-rad),IAA(Bio-rad,163-2109),KH2PO4(10017618,國藥)，NH4HCO3(Sigma,A6141);i TRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB,SCIEX),Acetonitrile,ACN(I59223-0123,Merck);C18Cartridge(66872-U,Sigma);5×上樣緩沖液；SDT Buffer;UA Buffer;Dissolution Buffer(AB,SCIEX)。
  3.3樣品的制備
  將不同類型的皮膚樣品分別置于研缽中，加入適量液氮研磨至粉狀，加入STD Buffer(150 mmol/L Tris-HCl,4%SDS,1 mmol/L DTT,p H=8.0)溶液600μL，勻漿，然后沸水浴5 min，用超聲波破碎(80 W,每次超聲8 s,間隔10 s,持續5 min)，置于沸水浴5 min,12 000 g離心持續15 min，提取上清液，進行BCA蛋白質定量。
  3.4 SDS-P AGE電泳
  在上述BCA法定量后的8份樣品中各取20μg，加入5×上樣緩沖液(體積比5∶1)，經5 min沸水水浴，10 min 14 000 g的高速離心后，提取上清液，用于進行12.5%的SDS-PAGE電泳(恒流:14 m A,持續90 min)，用考馬斯亮藍染色。
  3.5胰蛋白酶酶解
  各取200μg的裘皮樣品，用胰蛋白酶酶解，具體步驟詳見楊佐青等(2017)，得到酶解肽。
  3.6 i TRAQ標記
  參照OD280肽段定量的結果，分別取約80μg的4種不同毛股花穗型裘皮樣品，共8份，依據i TRAQ試劑盒說明書進行標記，將標記后的各組肽段混合，得到樣品標記信息(表4)。
  3.7毛細管高效液相色譜分析
  用Easy n LC液相系統分離上述標記的樣品，具體方法參照“應用i TRAQ技術對灘羊裘皮差異表達蛋白的研究”一文(楊佐青等,2017)。
  表4 樣品標記
  
  3.8質譜鑒定
  用Q-Exactive質譜儀對上述經色譜分離后的樣品進行MS分析，具體分析模式參照楊佐青等(2017)。
  3.9質譜數據分析
  用Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4(Thermo)軟件對經質譜鑒定產生的原始數據進行查庫(uniprot Ovis aries蛋白質庫)鑒定和定量分析，以FDR≤0.01為蛋白鑒定的過濾參數，肽段報告離子峰強度值選用Proteome Discoverer軟件進行定量分析。
  3.10差異蛋白分析
  以A1和A2兩份樣品的113和114兩組通道平均值為參數，其余各通道標簽與參數的比值即為各組蛋白質的i TRAQ比值。將鑒定出的蛋白質進行T檢驗與顯著性分析(p value)確定出存在顯著差異的蛋白。對得到的差異蛋白進行分析，當某一差異蛋白的豐度比在1.3以上或0.77以下，且其p<0.05時，則將該蛋白定義為不同樣品間的顯著差異蛋白。
  3.11生物信息學分析
  根據相似性原理，即序列相似的蛋白其功能也可能相似，將各比較組得到的差異蛋白與GO數據庫以及KEGG pathway數據庫進行對比，并對其進行GO注釋和KEGG通路分析，最終將具有同源性的蛋白的注釋信息分別轉嫁到各自所對應的差異蛋白上，以研究不同花穗型皮膚樣中存在表達差異的蛋白所起的生物學作用及其可能參與的機體代謝過程。